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實時熒光定量PCR服務在實際應用中的定量分析法

發(fā)布日期: 2020-01-10
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   實時熒光定量PCR是一種在擴增反應中,以熒光化學物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物的總量,通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定基因序列進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR服務包括SYBRGreen熒光定量和TaqMan探針PCR,提供檢驗設(shè)計,RNA提取、標準品制備,數(shù)據(jù)分析和詳盡的實驗報告。所謂實時熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。  
  1. Ct值的定義 
  在熒光定量PCR技術(shù)中,有一個很重要的概念 -- Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含義是:每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。  
  2. 熒光域值(threshold)的設(shè)定 
  PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍,即:threshold = 10 ′ SDcycle 3-15  
  3. Ct值與起始模板的關(guān)系 
  研究表明,每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標代Ct值。因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
  實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。